外泌体生物发生途径的启动源自胞外的分子物质通过内吞作用进入细胞。首先质膜向内出芽形成早期内体，这也是内体运输途径的第一站；它的作用是对内吞的分子物质(即内含物)进行初步分选。早期内体中的内含物将有不同的命运途径。需要回收的内含物将与高尔基体或质膜融合。不需要回收的内含物将集中在早期内体的中央液泡区域，并进入内体成熟途径，当囊泡成熟时，内体膜的某些区域开始内陷并从细胞质出芽进入内体的腔内空间。生成的腔内囊泡(intraluminal vesicle，ILVs)，形成MVBs。如果MVBs与溶酶体融合，ILVs的内含物将会被降解。然而，如果MVBs与质膜融合，ILVs将分泌到细胞外空间，成为外泌体

外泌体属于微囊泡体，它们通过质膜向内出芽进入早期内体，随后经过迁移和分选产生多囊泡体(MVB)，并形成腔内囊泡(ILVs)，当由此产生的多囊泡体(MVB)与质膜融合时，这些囊泡以外泌体的形式释放

主要介绍常见的外泌体分离方法，即超速离心、超滤、免疫亲和层析和尺寸排阻色谱，并对这些技术的优缺点进行比较。

A：超速离心。通过多次离心得到外泌体，离心力从 300 g 到 100 000 g，在每个离心步骤之后，去除细胞和细胞碎片，并收集上清液进行后续离心，离心在4℃下进行 B：密度梯度离心。通过从下到上逐渐降低密度层来制备等比密度梯度超速离心，长时间离心后，包括外泌体和其他细胞外组分在与每种组分密度相似的培养基中达到静止位置 C：尺寸排阻色谱法。当溶液通过由多孔树脂颗粒组成的固定相时，分子可以根据大小分离 D：免疫亲和层析。将含外泌体的液体与外泌体特异性抗体偶联的固体基质一起孵育后，可以将外泌体富集到固体基质上

超速离心(ultracentrifugation)是目前收集外泌体的经典方法，其原理主要是当非均质混合物受到离心力时，更致密的颗粒首先沉降到沉淀中。Altıntaᶊ等报道了一种典型的通过超速离心获得外泌体的方法：(1)培养基在300 g下离心10 min，分离活细胞；(2)收集上清液，在2 000 g下再次离心10 min，沉淀死细胞；(3)收集上清液，10 000 g离心30 min，清除细胞碎片；(4)收集上清液，在100 000 g下再次离心70 min，沉淀外泌体，收集颗粒，并用大量PBS洗涤以消除污染的蛋白质；(5)将所得溶液再次离心(100 000 g离心70 min)，最终获得外泌体。密度梯度超速离心(density gradient ultracentrifugation)是另一种使用密度梯度进行分离的替代技术。密度梯度超速离心是根据外泌体与其他成分之间大小和密度的差异，达到分离外泌体的目的。当需要额外的纯度时，使用密度梯度作为超速离心的延续可以更好地分离颗粒。具体步骤也是通过低速离心去除较大杂质，然后将样品加入分离介质顶部进行超速离心。目前蔗糖密度梯度超速离心是应用最多、研究最多的细胞器分离方法。而最近有研究针对脑组织分离外泌体的方法进行探究，并基于碘克沙醇的高分辨率密度梯度与先前描述的基于蔗糖的密度梯度进行了比较，结果发现虽然最终回收得到的EV总量相似，但基于碘克沙醇密度梯度比蔗糖密度梯度能更好地分离不同EVs亚群，包括微囊泡、外泌体和有丝分裂囊泡亚群。

通过超速离心的方式分离外泌体具有成本低、操作简单、方便、重复性好等优势，但是耗时长(可能需要十几个小时)、容易被污染，而且存在外泌体形态结构被破坏的风险。最重要的是，这种方法获取的外泌体产量非常低，据报道仅为5%。密度梯度超速离心方法的优点是外泌体形态结构相对完整，且不同EVs亚群分离后不会再混合；缺点是离心时间长、产量低，并且该方法无法有效分离与外泌体具有同等密度的物质(如微囊泡)。因此，随着离心技术的发展，将超速离心与密度梯度分离相结合可以显著提高外泌体的分离效果。

超滤(ultrafiltration)是一种基于分子大小的分离方法，是最简单的外泌体分离方法之一。外泌体是通过不同孔径或分子量切断(molecular weight cut off，MWCO)的过滤膜去除杂质获得的。大于MWCO的组分被过滤膜定量阻挡，而小于MWCO的其他组分(外泌体)可以随渗透物一起穿过过滤膜结构。对于离心分离，He等建立了一种高效优化的超滤方法。该装置依靠低速离心、0.22 μm过滤器和MWCO为10 000 kDa的透析膜，可以去除200 μm以上的杂质，浓缩物体积缩减到原始体积的1/50。与超速离心相比，超滤只需要低速离心，不影响外泌体的生物活性，具有操作简单、重复性好、低成本、富集效率高等优点，适用于大量样品。然而，它也有缺点，如需要额外的商业试剂盒，耗时(约150 min)，并且不适合血液样本。

总之，超滤是最简单的外泌体分离方法之一。外泌体可以从大量液体中分离出来，不需要昂贵的特殊设备和有害的化学试剂。然而，滤膜表面外泌体的堵塞可能导致回收率低。

免疫亲和层析(immunoaffinity chromatography，IAC)是一种基于抗体和配体特异性结合的分离纯化技术，能从异质混合物中分离出所需物质。结合效率与生物亲和对、洗脱条件和基质载体密切相关。原则上，该方法应用的生物标志物(抗原)应是外膜表面的高丰度蛋白质，如四跨膜蛋白超家族、ESCRT复合物相关蛋白等。当然，靶蛋白可以是外泌体表面的共同成分，也可以是促进免疫亲和层析识别特定细胞源性外泌体的唯一成分，因此利用免疫亲和层析可以将外泌体与其他EVs亚群特异性分离。然而免疫亲和层析获得的外泌体的储存条件比较苛刻，不适合外泌体大规模分离。基质的非特异性干扰吸附会产生干扰蛋白，使该方法难以推广。

与超速离心相比，免疫亲和层析可以在更少样品体积下产生类似结果。它也可用于外泌体的定性和定量测定。免疫亲和层析具有特异性强、灵敏度高、纯度高、产率高，且能保证外泌体形态结构完整等优点。定量检测分析发现，该方法收获的外泌体产量与超速离心相当，但样品需求量小得多。例如，利用免疫亲和层析从400 μL血浆中提取的RNA量与超速离心从2.5 mL样品提取的RNA量相同，因此相比于超速离心，免疫亲和层析具有一定优势。

尺寸排阻色谱法(size-exclusion chromatography，SEC)主要是指超滤和粒径排除色谱，根据生物样品中外泌体与其他组分的粒径差异进行分离。其分离原理是大分子不能进入凝胶孔隙，沿着多孔凝胶与流动相之间的间隙被洗脱，而小分子则留在凝胶孔隙中，最终被流动相洗脱。就外形大小而言，外泌体大约有几十纳米，这使得它们比典型的蛋白质要大得多。SEC使用填充有多孔聚合物珠的色谱柱可以允许不同半径的分子通过；半径较小的分子被迫沿着色谱柱的通道移动，因此在较晚的时间被洗脱。例如，外泌体在内的一些分子，其流体动力学半径太大，无法通过色谱柱的孔，而是在介质中快速移动，因此对复杂设备的需求较少，样品制备也很简单。声波流体分离是一种依赖于SEC的不同技术，它们暴露于不同的声学应力，这依赖于颗粒的大小进行分离。与超速离心分离外泌体相比，SEC的优点之一是保留了外泌体结构完整性和生物活性。因此，SEC是一种非常有效的分离外泌体方法。为了便于SEC分离外泌体，可使用市面上已有售卖的预包装色谱柱，如qEV (Izon Science)和hilload Superdex (GE Healthcare)。与沉淀分离EVs相比，使用SEC预填充柱具有快速方便、可重复性，且适用于许多样品类型等特点，但该方法也会降低外泌体回收率，且很难实现外泌体与其他EVs亚群的特异性分离，同时SEC得到的样本浓度较低，通常需要额外的浓缩步骤。

众所周知外泌体是具有脂质双层封闭结构的生物纳米颗粒。同时，由于外泌体脂质双分子层带负电荷，一些带正电荷的分子也很容易被用来富集外泌体。例如，用带正电荷的鱼精蛋白成功地从人唾液、血清和肝干细胞中纯化了外泌体。Kim和Shin开发了一种离子交换平台，该平台基于涂有阳离子聚合物的磁珠，用于从血浆中分离高纯度和高产量的外泌体。简而言之，多聚-L -赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)聚合物功能化磁珠与过滤后的血浆混合并孵育一段时间，在此过程中，由于静电反应，带正电荷的锁相环包被珠很容易与带负电荷的外泌体结合。最后，外泌体捕获的小珠子可以被磁铁吸引，然后除去额外的液体。基于膜的分离方法已经显示出分离较大外泌体的强大能力。同时，这些方法几乎不依赖于外泌体的表面蛋白，避免了外泌体本身异质性所导致的低纯度或低产量。值得注意的是，分离的外泌体可能含有其他带膜杂质，因为这些方法主要基于脂质双层封闭结构。

以往外泌体分离方法不能提供临床常规分离和分析所需的高纯度和回收率，微流体装置可以克服以往方法的局限性。此外，以往外泌体分离方法往往成本高、加工时间长，较难实现标准化流程也是其缺点。微流控技术为单个芯片上的外泌体分离、检测和分析提供了并行分离和传感能力。快速、高特异性和高灵敏可使即时诊断外泌体的无创液体活检用于个性化医疗和临床应用。

(1) 基于无标记的微流体方法。根据外泌体的密度和大小，有几种方法对它们进行分类。例如，据报道将声学与微流体相结合可直接从未稀释的全血样本中分离出高产量和纯外泌体。通过对外泌体施加不同大小和密度的声力，能够直接从全血中分离出不同大小的颗粒。微流控装置的细胞去除单元用于分离直径为1 μm的血液成分，包括白细胞、红细胞和血小板，以获得无细胞血浆，随后将前一阶段的产物送到外泌体分离单元，进一步分离纳米级生物颗粒的下游外泌体，该单元能够区分外泌体亚群。外泌体具有生物相容性，基于无标记的微流体方法具有保留分离外泌体特性、结构和功能的潜力。此外，自动化外泌体分离可以缩短处理时间，控制生物危害，并通过下游外泌体分析仪，大大减少人为干预，提供可重复的结果。

(2) 基于标记(免疫亲和)的微流体方法。基于标签的方法可提高分离外泌体的特异性。标志物是外泌体表面选择性表达的抗原，如CD63和EpCAM等。如前所述，将无标记检测方法与基于标记的方法相结合来分离外泌体已经取得了很好的结果。已有研究基于免疫亲和的微流控装置，鉴定出浆液性卵巢癌细胞系中表达的外泌体蛋白，与正常细胞相比，最多可达20种。同时分析发现HGF和STAT3被确定为首要调控蛋白。基于外泌体生物标志物的发现可用于高级别浆液性卵巢癌的早期检测和特异性途径新靶向治疗的开发，从而可能改善浆液性卵巢癌女性的临床结果。据报道，ExoChip等微流体装置已用于商业用途。常规ExoChip主要是用CD63作为特异性标记抗原，但新型装置同时使用CD63和磷脂酰丝氨酸特异性蛋白来增加外泌体分离的特异性，同时该新装置对健康外泌体的捕获效率为38%，对癌细胞外泌体的捕获效率为90%，相比于ExoChip多分离35%的外泌体。此外，捕获的外泌体很容易被Ca²⁺螯合释放，进而完成外泌体的下游分析。另一种名为ExoSearch的装置使用免疫磁珠对卵巢癌患者血浆中的EpCAM、CD24和CA125等外泌体肿瘤标志物进行多重检测，该装置显示出与标准Bradford法相当的诊断性能。

虽然外泌体分离和纯化方法的大多数早期研究都是对从细胞培养基中收获的材料进行的(常用分离方法总结见表1)，但组织体液中的外泌体往往具有巨大的科学和临床兴趣(如血液、尿液、恶性腹水)。现阶段科学研究从血液中分离外泌体仍存在巨大挑战，如往往有价值的生物样本的可用性有限、存在高丰度蛋白质和脂蛋白颗粒以及血液中存在多种源自不同细胞类型的外泌体(尽管绝大多数源自红细胞和血小板)。此外，外泌体表面可能含有糖蛋白或糖脂，如果采用超速离心分离方法，可能会导致外泌体颗粒聚集和产量低。因此，如果将外泌体应用到后续临床诊断/疾病预后，需要进一步标准化外泌体分离步骤的关键参数，如血液采集、处理和储存以及从血浆中分离外泌体的方法。目前有研究认为：SEC与膜过滤结合是从血浆/血清中分离外泌体的首选程序。研究表明，反复超速离心会显著影响外泌体的完整性及回收。与超速离心相比，超滤装置可提供更快、更高的外泌体产量。研究人员发现超滤与SEC联用是一种与密度梯度离心相当的纯化方法，适用于在有效时间范围内从细胞培养上清液和人血浆中分离出高产量外泌体。Tiwari等进一步比较了在血液和尿液样本中不同外泌体分离方案以及几种分析类型(流式细胞术、纳米粒子跟踪分析和透射电子显微镜)。表2总结了从不同体液中分离外泌体的方法。

外泌体广泛用于疾病诊断和预后的生物标志物，目前主要应用于癌症以及心血管疾病、结核病和中枢神经系统疾病等领域。研究表明，急性心肌梗死和心力衰竭患者中与心血管疾病相关的外泌体miRNA水平上调，包括miR-499、miR-133、miR-208、miR-192、miR-194、miRNA-34a等为其用作临床诊断标志物提供了坚实的基础。Dysferlinopathy是一种因缺乏dysferlin而引起的遗传性肌肉疾病，有研究人员通过分离纯化该疾病患者血清和尿液中的外泌体，发现无法在患者体内的外泌体中检测到dysferlin，进而用于Dysferlinopathy的诊断。另外，研究发现外泌体中的miR-21、miR-423-5p、miR-149、miR-99a-3p、RASSF10、miR-423-5p在垂体腺瘤疾病中差异表达，显示出良好的临床诊断潜力。在癌症诊断方面，由于癌细胞来源的外泌体含有各种生物分子，并分泌到血液中，因此外泌体往往可以作为癌症的诊断/预后标志物。与健康对照组相比，上皮癌患者血浆外泌体miR-320d、miR-4479和miR-6763-5p水平显著降低。同时外泌体miRNAs水平升高可能是恶性癌症的一个重要标志，可以作为临床状态指标。另外，血清外泌体来源的miRNAs可以判断患者是否患有肝癌。研究表明，乳腺癌患者血清的外泌体中miR-21、miR-155、miR-182和miR-373的表达水平高于健康对照组。通过RNA测序检测患者尿液中的外泌体lncRNAs可以鉴定是否患有膀胱癌。另外，与健康对照组相比，口腔和口咽鳞状细胞癌患者唾液中外泌体的miR-486-5p显著升高，而miR-10b-5p则显著降低，这些报道均表明外泌体非编码RNA可以作为诊断标志物。

另外，研究发现外泌体miR-134表达水平较低的胃癌患者总生存期较短。化疗后完全康复的急性髓系白血病患者体内外泌体LINC00265和LINC00467的表达水平显著升高。外泌体miR-7-5p通过抑制MAPK相互作用蛋白激酶(MAPK-interacting protein kinase，MNK)/真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)信号通路，显著增强依维莫司(一种抗肿瘤药物)的治疗效果，这意味着高水平外泌体miR-7-5p可以预测患者对化疗的有利反应。同时研究表明LINC00963高水平表达可预测肺癌患者预后的不良反应，以及lncRNA如AL355353.1、AC011468.1和AL354919.2在膀胱癌组织中表达上调，高水平AL354919.2也预示膀胱癌患者预后效果不佳。胆汁外泌体miR-200a-3p、miR-200c-3p及血清外泌体miR-200c-3p的表达水平高可预测胆管癌患者预后不良。综上所述，外泌体非编码RNAs可以作为临床诊断/预后标志物。

抗肿瘤的化疗药物可成功杀死快速发展的肿瘤细胞。然而，这些药物同样能损害正常健康的细胞，产生严重副作用。此外，一些疏水药物难以特异性靶向肿瘤细胞。因此，这些配方需要更特异和高效的载体。由于外泌体稳定的脂质双分子层结构，成为化疗药物靶向肿瘤干细胞的有效载体。在动物肿瘤模型中，外泌体介导的药物递送已被证明比直接应用抗癌药物具有更好的抗肿瘤作用。例如，紫杉醇是一种抗有丝分裂化疗药物，通常用于癌症治疗，装载有紫杉醇的巨噬细胞衍生的外泌体靶向癌细胞，表现出高抗癌功效。有研究利用超声处理直接将紫杉醇装载到外泌体中并在体外处理癌细胞，发现抑癌效果比游离紫杉醇高50倍。同时在肺癌大鼠模型中，外泌体包裹的紫杉醇显著降低肿瘤大小并阻止肺癌细胞转移，这表明外泌体中含有的紫杉醇可直接靶向癌症干细胞。此外，经紫杉醇处理的间充质干细胞产生的外泌体对胰腺肿瘤细胞具有显著的抑制活性。

疫苗是降低传染病发病率和死亡率的重要工具。据报道，疫苗每年在全世界至少挽救200万~ 300万人的生命。传统疫苗技术已广泛应用于预防细菌和病毒病原体的感染，但不能治愈一些持续性感染以及新出现的病原体，因此开发新型疫苗技术至关重要。而外泌体可以将抗原呈递到树突状细胞(dendritic cell，DC)中发挥作用，引起特异性免疫反应，使其成为疫苗的理想介质。为了提高外泌体的靶向性，许多研究都对外泌体进行了基因工程改造，以表达特定的抗原分子或靶向癌细胞。为了实现外泌体的基因修饰，科研人员设计并开发了一种新的外泌体平台 (synthetic multivalent antibody retargeted exosome，SMART-Exo)。

目前有两种方法将抗原分子装载到外泌体上：一种是将抗原装载到树突状细胞中，然后收集细胞上清液分离外泌体，实现间接装载抗原，从而确保抗原与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)结合，然而这种策略的局限性在于抗原的类型必须被树突状细胞识别；另一种是任何可溶性抗原都可以附着在外泌体上，并且可以用来修饰具有附加功能的外泌体，如向外泌体添加黏附因子，可以靶向某些位点。

CRISPR/Cas系统可以精确地操纵DNA序列来改变细胞和器官的特征，这在研究疾病的致病机制和治疗中具有非常大的潜力。尽管CRISPR基因组编辑技术取得了巨大进步，但由于缺乏有效的递送载体，CRISPR/Cas组件的体内递送迄今为止一直具有挑战性。理想情况下，有效载体应具有安全性、稳定性、无毒性和非免疫原性，以便将CRISPR/Cas9的治疗有效载荷传递到靶细胞的细胞核中，同时最大限度地减少脱靶事件的发生。为了促进CRISPR/Cas9系统的临床应用，许多已经发表的研究试图探索和研究递送选择。近年来，病毒和非病毒携带者越来越受欢迎。尽管迄今为止腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)作为病毒载体的基因编辑治疗已经取得了重大进展，但它们的应用仍然面临着重大障碍，如宿主产生针对AAV衣壳的中和抗体、递送的CRISPR/Cas9元件表达异常以及应用成本高等。另外，非病毒载体包括脂质体、聚合纳米颗粒和金属纳米颗粒被认为是有效的替代方法，它们具有更好的安全性、易于合成、位点特异性、递送大片段基因的能力和低成本等优点。然而值得注意的是非病毒载体存在低特异性、低转染效率、生物相容性和细胞毒性等问题。

外泌体是由细胞自然分泌的纳米级膜囊泡，可以携带和运送质粒、蛋白质、siRNAs、miRNAs和其他生物分子等不同的内含物到受体细胞，这可能成为一种新的无细胞治疗模式。与合成药物载体不同，如果从相容的细胞来源分离，外泌体通常具有免疫惰性，没有细胞毒性作用。此外，由于gRNA和Cas9的细胞内稳定性较低，外泌体作为递送载体大大降低了脱靶风险，提高了基因组整合机会。因此，外泌体已成为CRISPR/Cas9基因治疗的有效递送载体，可以潜在地克服病毒和非病毒载体相关的主要缺陷问题，也是目前CRISPR/Cas9工具最安全、最有效的载体之一。