高光谱显微镜对蚊子幼虫体内聚苯乙烯微塑料的非荧光跟踪
文章来源：发布时间：2025-03-27 08:49:33浏览数量：
文献摘要:随着塑料材料的生产和消费不断增加，微塑料（直径小于5毫米）和纳米塑料（直径小于1微米）污染已成为全球性的环境问题。这些微小的塑料颗粒不仅广泛存在于水体中，还可能对水生生物产生不利影响，并对人类健康构成潜在威胁。微塑料的分布和环境影响已成为环境化学领域的研究热点，常用的检测方法包括红外光谱、拉曼光谱等。然而，微塑料研究的核心问题之一是其对生物体（包括人类）的毒性，以及其在生物体内的吸收和分布情况。为了研究微塑料的生物效应，通常使用合成的聚合物胶体微粒（如聚苯乙烯微粒）作为模型。然而，荧光标记的微塑料虽然便于检测，但标记过程可能影响颗粒的化学性质，且荧光信号在组织学处理过程中容易受到干扰。因此，开发一种不依赖荧光标记的检测方法对于微塑料的生物分布研究具有重要意义。研究目的：
本研究目的在于评估和比较荧光成像与高光谱显微镜在追踪蚊子幼虫体内荧光标记聚苯乙烯（PS）微塑料分布方面的效率。研究旨在提出一种增强的暗场显微镜结合高光谱成像的方法，用于分析复杂组织中聚合物胶体（微塑料）的生物分布，以期为理解微塑料对生物体（包括人类）的潜在毒性及其在环境中的传播提供重要的科学依据。
主要发现：
1.在经过组织学处理后，荧光标记的PS的荧光特性会受到严重影响，表明荧光标记在某些情况下可能无法有效用于微塑料的检测；
2.通过纳米高光谱显微成像技术能够无需荧光标记即可检测和定位蚊子幼虫体内的PS，即使在经过组织学处理的样本中也能准确识别微塑料的分布；
3.研究发现2 μm的PS主要在蚊子幼虫的中肠内积累，并且以聚集体的形式存在；
纳米高光谱显微成像方法：
1.PS样本的制备：购买商品化的荧光标记的黄绿色羧酸修饰聚苯乙烯球体，并使用超纯水（18.2 MΩ cm）制备0.1%的PS水悬浮液。超声处理后，将PS颗粒在Bouin溶液中孵育40分钟以模拟组织学固定过程，然后用超纯水洗涤。
2. 蚊子幼虫的培养：在25 ± 2°C、70 ± 5%相对湿度和16L:8D的光周期条件下，使用去氯自来水培养幼虫。喂食干燥的牛肝粉末和荨麻叶粉末的混合物。将第三龄幼虫放入含有自来水的培养皿中，并在实验组中添加PS颗粒。
3.组织学切片：幼虫在Bouin溶液中固定24小时，然后在乙醇溶液中脱水，用丁醇透明化，浸入石蜡中，制备5 μm厚的连续矢状切片。切片固定在SuperFrost载玻片上，用环己烷脱蜡，储存以备显微镜分析。
4.样本观察：使用纳米高光谱显微成像系统来观察水悬浮液中的微塑料颗粒和组织学切片中的微塑料颗粒。
结果分析：
Fig. 1展示了使用纳米高光谱显微成像技术对不同样本中PS微塑料的成像和分析结果。Fig. 1a显示了水悬浮液中未经处理的2μm荧光标记的PS颗粒的真实色彩暗场图像，Fig. 1e则是对应的高光谱图像，其中通过SAM算法生成的分类图以假彩色显示，突出了PS颗粒的分布。通过对比这些图像，可以发现未经处理的PS颗粒在水悬浮液中显示出明显的荧光特性（Fig. 1a和e），而经过Bouin溶液处理后，PS颗粒的荧光特性显著减弱或消失（Fig. 1b和f），这可能是由于Bouin溶液中的化学成分影响了PS颗粒的荧光性质。在蚊子幼虫组织切片中，无论是在疏水环境还是石蜡包埋的样本中，PS颗粒的分布都可以通过纳米高光谱显微成像技术清晰地识别出来（Fig. 1c, d, g, h），这表明即使在复杂的生物组织环境中，高光谱成像技术也能够有效地检测和映射微塑料颗粒。
Fig. 1. 第一行展示了真彩色增强暗场图像，第二行则呈现了由 SAM 算法生成的分类图（伪彩色）叠加的相应高光谱图像。这些图像显示了 2 μm荧光原始聚苯乙烯（PS）（a、e）和 Bouin 处理过的 PS（b、f）的水悬浮液，以及嵌入疏水环境（c、g）和嵌入石蜡（d、h）的伊蚊幼虫切片中颗粒的分布情况。
结论：
本研究发现尽管荧光标记的PS 在经过组织学处理后荧光特性可能会受到影响，但通过使用纳米高光谱显微成像技术，能够在无需荧光标记的情况下成功地在蚊子幼虫体内可视化和映射2μm直径的PS。利用光谱角映射算法，精确地在水悬浮液和蚊子幼虫切片中识别和分布这些微塑料，证明了其在组织学分析中，尤其是在荧光特性可能受损的情况下，作为一种可靠和详细的可视化方法的潜力。因此，纳米高光谱显微成像技术为微塑料的生物分布分析提供了一种有效工具，有助于更深入地理解微塑料在生物体内的存在和影响。